[文献浏览·miR与肝癌]miR-28-

[文献浏览·miR与肝癌]miR-28-

原文来源：Shao-LaiZhou,Zhi-QiangHuetal（复旦大学）PATOLOGY;doi:10./hep.（IF11.71）

[背景知识]

癌症的转移造成了肿瘤病例中90%的死亡。肿瘤转移的进程包括癌细胞从原癌组织逃脱、局部入侵到周围组织、进入全身的血液循环、在血管中存活并带到远处的组织器官、从血管中溢出进入实质组织，进而实现了微小转移，构成癌症转移产物。很多研究都在探究造成肿瘤转移的癌症细胞本身的特性和对转移有影响的外在微环境因子，但转移机制还没有明确。MiRNA是一类能够调理多种生物进程的非编码RNA，它通过调理靶向基因的表达进而发挥其作用。MiRNA的异常表达出现在多种癌症中，miRNA的作用也在癌症中逐渐显现出来。肿瘤细胞的转移是由肿瘤细胞本身特性和外在影响因子决定的，MiRNA能够调理这二者增进其转移。肝细胞癌（HCC）是一种恶性肿瘤，术后复发率高，易转移，因此研究MiRNA在HCC转移中的机理是迫切的，这将产生新的MiRNA作为诊断标记和可能的医治靶标。

[实验设计]

临床样本（miR-Seq）挑选差异miR

↓

差异miR体内外验证及其靶基因肯定

↓

差异miR带来的表型改变

↓

机制

↓

临床数据进一步验证

[实验结果]

RNA-p的下调与HCC的转移和预后不良相干

为了鉴定调控HCC转移的MiRNA，首先进行了不同转移能力的HCC细胞系的测序，（MHCC97L，MHCC97H和HCCLM3，它们来源于相同的遗传背景，但具有不同的向肺部转移的能力。）也测序了HCCLM3-RFP裸鼠后的肺部转移Y移植瘤。鉴定出个MiRNA，其中MiRNA的TPM（每百万表达量）均值大于10，在这个MiRNA中，有12个与转移能力正相干，有10个成负相干。有趣的是：MiRNA-P和MiRNA-p来源于相同的转录本，表达量多且与转移能力成负相干。因此探究这两种MiRNA的作用。

作者随后比较了这两种miRNA在多种不同转移能力的HCC细胞系中的表达量。发现与正常细胞系相比，6种HCC细胞系MiRNA-p的表达量明显下调，而MiRNA-p无此现象。MiRNA-p的表达量在3种转移能力强的HCC细胞系中低于3种无迁移能力的HCC细胞系。在组织中，MiRNA-p在肿瘤组织中表达量低于肿瘤旁正常细胞。另外肿瘤转移和复发的病人的MiRNA-p水平比无转移复发的病人低。MiRNA-p表达高的病人比低的病人预后更好。综上，MiRNA-p在HCC病人下调，尤其是HCC转移的病人中，这就意味着，MiRNA-p在HCC发展过程中可能发挥作用。

RNA-p缺失在裸鼠中增进了肿瘤的生长和转移，而在体外HCC细胞中无生物特性的改变。

为了探究MiRNA-p在HCC中的生物功能。作者在低表达MiRNA-p的HCC细胞系HCCLM3中过表达MiRNA-p，在正常表达MiRNA-p的细胞系HepG2中敲除MiRNA-p,发现细胞的增殖并没有改变。一样，也发现其对迁移，凋亡，入侵和附着没啥影响。

接着，作者构建HCC裸鼠移植瘤模型，发现单纯的HCCLM3造成的肿瘤比过表达MiRNA-p-HCCLM3的要大，一样，在HepG2裸鼠模型中发现，anti-MiRNA-p-HepG2裸鼠中瘤体要小于MiRNA-p-HepG2。（注意：此处选择的两种细胞系是由于HCCLM3内源性的miR-p低而HepG2高，所以对应的过表达和抑制，FIG1B，这类思路在miR-肿瘤实验设计中常常采取）并且作者也视察了对应的移植瘤在体内（肺部）转移率，一样出现了上述类似的效果，即：MiRNA-p高的小鼠转移率低。

好了，到此，所有的表型实验都做完了，也就是说，作者的切入点找到了，明确了两件事：第一，挑选出差异表达的MiRNA-p，第二，差异表达的MiRNA-p与肿瘤迁移有关。这也是作者接下来要探索的，即HOW?andWHY？

-34是MiRNA-p下游的靶标

上述实验告知了我们，MiRNA-p可能通过细胞非自主的机制发挥着肿瘤抑制作用。MiRNA中一种细胞非自主的途径发挥其作用的机制是通过分泌细胞因子/趋化因子影响肿瘤的微环境。因此作者探究MiRNA-p对种常见的细胞因子/趋化因子表达的影响，进而分析靶向基因。因而作者发现，将过表达MiRNA--pHCCLM3时细胞因子/趋化因子，和anti-MiRNA-pHepG2时细胞因子，同时结合TargetScan预测的MiRNA-p靶基因取交集，发现只有IL-34。因而接下来就是要验证靶基因了，首先，视察IL-34的mRNA和蛋白水平上是不是与miR-p相干，其次，就是双荧光素酶报告实验，进一步肯定了结合位点。综上结果证实了IL-34是MiRNA-p的下游目的基因。

（这一步是最基本的miRNA靶基因验证实验：通常是1，证明负相干，2，荧光素报告实验）

-34通过激活巨噬细胞FAK和ERK1/2增进增殖和趋化迁移。

这个研究发现啊，IL34作为巨噬细胞集落刺激因子CSF-1R的配体在单核细胞/巨噬细胞的产生、存活、发挥功能中起重要作用。因此作者测试IL-34在巨噬细胞的增殖和趋化迁移中的作用。体外实验发现，巨噬细胞确切产生了对IL-34浓度依赖性的增殖和趋化。为了研究其背后的机理，作者通过Westernblotting实验测试了与巨噬细胞功能相干的几个信号通路。发现IL-34处理后明显增加了FAK和ERK1/2的磷酸化水平，这类增强作用可以用相应的抑制剂消除。说明IL-34调理巨噬细胞是通过FAK和ERK1/2信号通路。

随后，作者分别用来自高表达（HCCLM3和HepG2-IL-34）和低表达（HCCLM3-shRNA-IL-34和HepG2）IL-34的HCC细胞产生的条件培养基（CM）测试巨噬细胞的迁移和增殖能力，发现高浓度的IL4确切能够引诱巨噬细胞趋化和增殖。并且在使用anti-IL-34抗体后改变了这类趋势。这就证实了IL-34增进巨噬细胞的激增和迁移。

-34通过肿瘤相干的巨噬细胞（TAM）的侵入从而增进HCC生长和迁移

为了探究IL-34在HCC发展中的调节作用，作者上调和下调了IL-34在HCC细胞系中的表达量，发现并未对体外细胞的生物特性产生影响（包括增殖，凋亡，粘附等）这一点类似之前miRNA-P的改变一样，作者这样做，更进一步侧面证实了IL-34是其靶基因，并且排除后续一些表型的干扰。但是在体内移植瘤实验中发现上调IL-34增进肿瘤的生长和迁移，下调则抑制。并且还发现上调IL-34后，F4/80+TAMs侵入增多，下调减少。而其他侵入肿瘤的基质细胞数量并未明显遭到IL34的影响。

接下来，作者探究TAMs在IL-34介导HCC发展过程中的作用。首先作者使用氯膦酸盐脂质体将小鼠TAMs耗尽，发现移植瘤体显著变小，而这与敲除IL-34致使的现象相同，并且在TAM耗尽的过表达IL-34移植瘤模型中发现，先前IL过表达造成的表型改变也被消除。因此说明IL-34在HCC发展过程中的作用是通过体内招募TAMs的。

RNA-p缺失致使IL-34的上调进而通过TAMs浸润介导增进肿瘤的增长和迁移

好了，作者已证实了miRNA-P能够影响HCC的迁移，而IL-34可以通过召募TAM来增进肿瘤迁移等，但是，IL34又是miRNA-P的靶基因，那末，是否是在缺失miRNA-P表达后也会造成一样的表型呢？因而作者把在IL34那一套又来了1遍，结果发现啊，miRNA-P缺失后的那些表型改变（体内，体外）都是依赖于IL-34介导的TAM浸润。

其实，做到这个地方，故事仿佛已要结束了，即便是到这里，故事也还是完全的，但是，常常高分的文章之所以能够分高，是由于他们能想的更深，更多。

M产生的TGF-β抑制miRNA-p在HCC细胞中的表达

之前的研究结果是miRNA-p低表达致使IL-34上调从而召募TAM浸润从而调控HCC的进展。有意思的是（此处应该是之外发现，可能作者本意是差不多类似于一个过表达TAM实验），TAM共培养发现其能够抑制miRNA-p的表达，并且伴随着IL-34的增加。另外，共培养后的培养液培养巨噬细胞发现，增殖及迁移能力均显著增加，并且这类现象在过表达miRNA-p或敲除IL-34后消失。那末到底是什么原因致使了TAM反馈调理miRNA-p呢？作者用ELISA将TAM产生的细胞因子都测了下，并且使用对应中和抗体，看看究竟是哪个在抑制miRNA-p的表达，作者这么一试还真的找出了，他就是TGF-β由此作者得出了这样的一个调控回路：miR-p-IL-34-巨噬细胞-正反馈回路.

RNA-p，IL34，和TAM可以作为肝癌患者预后状态参考

最后从临床动身最后还是落到临床上来，使得真个研究课题变得那末有意义。

，所以最后作者通过临床中肝癌患者生存分析与体内这些指标的关系，结果也如预期所料。

从临床到实验室机制最后又回到临床，这也是这类文章的1大特点。

的话：

文章的思路比较清晰，高分文章里面很多实验技术，手段很烧钱的，这类思路的文章其实还是不难想到的。miRNA作为研究工具，公道，善于利用还是很可以做一些质量可以的文章的。

本文一个创新点在于不同于以往miRNA-肿瘤文章（传统套路是mir-靶基因-肿瘤表型-机制）而，本文将落脚点定在肿瘤的微环境，而不是靶基因直接致使肿瘤表型的改变，因此，这也给广大研究肿瘤，miRNA提供了一个思路，其实不一定要纠结于传统四件套（凋亡，增殖，迁移，粘附）。

最后，感谢浙江大学董同学的

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