人参皂苷Rh2诱导人肝癌HepG2细胞凋

人参皂苷Rh2诱导人肝癌HepG2细胞凋

摘要:目的研究人参皂苷Rh2(G-Rh2)对肝癌HepG2细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用,并探讨其作用机制。方法用终浓度为5、10、20mg/L的G-Rh2作用于HepG2细胞,于24h、48h及72h后采用MTT法检测细胞增殖抑制率;72h后收集各组肝癌HepG2细胞,流式细胞术检测细胞周期及凋亡率;RT-PCR检测survivinmRNA表达。结果MTT法检测显示,G-Rh2对肝癌HepG2细胞有增殖抑制作用,并存在浓度和时间依赖关系;流式细胞仪检测显示G-Rh2作用后,细胞被阻滞于G0/G1期,随药物质量浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加。RT-PCR结果显示,GRh2下调肝癌HepG2细胞survivinmRNA表达。结论G-Rh2在体外对肝癌HepG2细胞有明显的增殖抑制和凋亡诱导作用,初步推断G-Rh2诱发肝癌细胞凋亡的作用与其对survivin基因表达的抑制有关。

关键词:肝细胞癌;hepG2;Rh2;凋亡

人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、增强免疫力等多种生物学活性。人参皂苷是人参中主要的活性成分。人参皂苷单体Rh2(G-Rh2)是从红参中分离得到的原人参二醇型单糖链皂苷单体化合物,在一些肿瘤细胞体外培养系中观察到其对肿瘤细胞增殖的抑制作用,并初步探讨该过程与诱导细胞凋亡及阻滞细胞周期等有关。而目前缺少关于G-Rh2对肝癌细胞增殖抑制及其相关分子机制的研究报道。本研究以人肝癌细胞株HepG2为研究对象,观察不同浓度G-Rh2诱导肝癌细胞凋亡的作用,并初步探讨其分子机制。

1材料与方法

1.1试剂

G-Rh2由吉林大学分析化学教研室提供,纯度大于99%;培养基和新生小牛血清(FBS)购自杭州四季青生物有限公司;MTT购自Sig-ma公司。survivin引物由上海生工生物技术公司合成,Trizol试剂,MMLV逆转录试剂盒,PCR试剂盒均购自Invitrogen公司,紫外凝胶显像仪(美国)。

1.2细胞来源及培养

人肝癌细胞系(HepG2)细胞购自于上海中科院细胞库室,经常规复苏后培养和维持在体积分数为10%FBS的培养液里,置CO2培养箱(37,5%CO2)培养,取对数生长期细胞经24h无血清培养后,分组进行实验。

1.3MTT法检测细胞生长抑制

取对数生长期细胞以密度为3*/ml,接种于96孔培养板、每孔μl。细胞贴壁后随机分组,空白组、G-Rh2(5、10、20mg/L)组,G-Rh2(10mg/L)给药24、48、72h组。每一浓度均设3个复孔,同时设有对照孔。培养结束前加MTT(5g/L)15μll,继续孵育4h后每孔加μlDMSO,震荡10min,用酶标仪测定nm各孔光吸收值(A值)。计算细胞生长抑制率,抑制率≥30%为细胞对该药敏感。细胞生长抑制率(%)=(1-加药组A值/对照组A值)*00%

1.4流式细胞仪检测细胞凋亡及周期

对数生长期细胞经0.25%胰酶消化后传代接种于培养瓶中,每瓶细胞1*,24h后加药,G-Rh2终浓度为5mg/L、10mg/L和20mg/L,对照组加等体积PBS,各瓶终体积为4ml,72h后收集各组细胞,用冷PBS(pH7.2)清洗2次,70%的冷乙醇4固定24h。用FACStarpous流式细胞仪检测,计算凋亡率和各期细胞所占比例。

1.5T-PCR检测基因变化

对数生长期细胞按每瓶细胞1*接种,24h后向后两组细胞加药(分组同1.4),继续培养72h后收集全部四组细胞,按Trizol操作说明,提取RNA,紫外分光光度计定量。RNA样品经逆转录反应合成cDNA,然后进行PCR扩增,以GAPDH为内参,观察survivinmRNA表达情况。survivin扩增产物为bp:上游引物为5’-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3’;下游引物为5’-AGCCAGTCCCCCACAGCAT-3’。GAPDH扩增产物为bp,上游引物为:5’-GG2GAAACTGTGGCGTGAT-3’下游引物为:5’-AAAGGTGGAG2GAGTGGGT-3’。PCR产物经1%琼脂糖凝胶系统电泳(含溴化乙啶),拍照鉴定和分析。

1.6统计学处理

采用SPSS12.0统计软件对数据进行处理,使用x2检验进行统计分析。

2结果

2.1G-Rh2对HepG2细胞增殖的影响

对照组细胞体外生长活跃,经5、10及20mg/LG-Rh2作用后，HepG2细胞增殖均有不同程度受到抑制,与阴性对照组比较差异具有显著性(P0.01),且Rh2对肝癌HepG2细胞生长抑制影响呈剂量依赖性,和时间依赖性。增殖抑制率随着G-Rh2剂量增加而增加;加用10mg/LG-Rh2后24、48及72h的细胞增殖抑制率随时间延长而增加。如图1。

2.2G-Rh2对HepG2细胞周期及凋亡率的影响

3种浓度的G-Rh2作用HepG2细胞72h后,可影响细胞周期分布,G0/G1期和G2/M期细胞百分比上升,S期细胞百分比下降,细胞凋亡率随药物剂量增加而逐渐增加,详见表1。

2.3G-Rh-2对HepG2细胞survivinmRNA表达的影响

Survivin和GAPDH扩增片段长度分别为bp和bp。5,10,20mg/LG-Rh2组survivin表达抑制率为41.02%,61.16%和88.69%。对survivin基因表达抑制率随G-Rh2剂量增加而增加,详见图2。

3讨论

人参皂苷是人参的主要活性成分,在人参皂苷单体中G-Rh2的抑瘤活性最强,体内外实验结果表明G-Rh2时间和剂量依赖性地抑制宫颈癌、脑胶质瘤、肺癌等多种肿瘤细胞的增殖,且其诱导凋亡与抑制增殖呈正相关,但目前未见G-Rh2对人肝癌细胞HepG2增殖抑制作用的研究。Kim等研究表明G-Rh2有诱导小鼠胶质瘤细胞凋亡的作用。马文彬等应用流式细胞仪研究G-Rh2对S肉瘤细胞周期移行的影响,发现GS-Rh2能引起细胞周期阻滞于S期。为进一步探讨G-Rh2抑制细胞生长的机理,我们检测了G-Rh2作用后HepG2细胞凋亡率(AR)以及细胞周期变化。结果显示本实验结果表明G-Rh2可以使肿瘤细胞周期阻滞,G1期细胞增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,抑制细胞G1期的RNA合成,从而延缓肿瘤细胞的增殖,G-Rh2可使HepG2细胞G1期阻滞,不能进入S期,阻滞G1期细胞向S期的转化进程,从而使G2/M期细胞相对增多。HepG2细胞的凋亡率在一定范围内具有随药物浓度增高而增高的趋势。由此提示:在一定范围内,G-Rh2诱导细胞凋亡呈剂量依赖性和时间依赖性。

Survivin是新近发现的一种凋亡抑制蛋白(inhibitionapoptosisprotein,IAP),在正常组织、终末分化组织中表达阴性,而在绝大多数肿瘤组织中表达阳性,与肿瘤的预后密切相关。其作用机制与IAP家族的其他蛋白相似,系通过抑制caspase-3和7酶原的活性,抑制细胞凋亡;另外,Survivin还通过与纺锤体纤维的结合,间接地抑制caspase酶对纺锤体的水解作用,保护有丝分裂细胞器的完整性,发挥抑制细胞的凋亡的作用。本实验结果证实,GS-Rh2能抑制肝癌HepG2细胞Survivin基因的表达,而且随着药物浓度的增加,对Survivin基因的表达的抑制作用也增加。G-Rh2在体外对肝癌细胞HepG2有明显的增殖抑制作用和凋亡诱导作用,初步推断其对survivinmRNA表达的抑制可能是G-Rh2诱发肝癌细胞凋亡的主要原因之一。但对其作用机理仍需进一步的探讨。

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