一文读懂测序技术揭秘肠道菌群与肝癌免

肿瘤免疫治疗是肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有前景的一种治疗手段，《Science》杂志将其评为年“十大科学突破”之一。肠道是人体内最大的淋巴器官，存在超过70%的T细胞，是绝大多数记忆T细胞的居住地。肠道菌群可以通过直接物理接触、代谢产物以及肠道粘膜结构成分改变等多种机制与宿主免疫系统相互作用。年初，国际顶级期刊《Science》杂志连发三篇重磅文章，聚焦肠道微生物对肿瘤免疫治疗的重要影响，证实在人体中肠道菌群会影响肿瘤免疫治疗的疗效。

年7月，医院肿瘤内科团队基于华大智造DNBSEQ技术平台在《JournalforImmunoTherapyofCancer》合作发表研究成果《Gutmicrobiomeaffectstheresponsetoanti-PD-1immunotherapyinpatientswithhepatocellularcarcinoma》。研究采用深度宏基因组测序的方法，研究肝细胞性肝癌患者接受抗PD-1治疗的过程中肠道菌群的变化特征，鉴定出与治疗响应度密切相关的菌群及其代谢特征，旨在为进一步探究肠道菌群与宿主免疫应答的关系初步奠定理论基础。研究背景肝细胞癌因恶性程度高、预后差以及死亡率高，被列为全球第四大癌症。目前，口服多激酶抑制剂索拉非尼是标准的晚期HCC全身治疗方法，其客观缓解率低于5%。近年来，抗PD-1免疫阻断疗法在肝癌治疗中显示出良好的治疗效果。但是影响肝癌抗PD-1免疫响应的因素尚未可知。该研究主要作者、上海锐翌生物技术负责人王婷婷博士表示，越来越多的研究表明肠道菌群与抗肿瘤免疫相关，但却鲜有有关于肝癌免疫治疗和肠道菌群的研究。所以，上海锐翌生物与浙江大医院肿瘤内科方维佳教授团队一起设计了这项专有研究项目。旨在以肠道菌群为出发点，通过宏基因组测序的方法填补这方面研究的空白。该项研究纳入的参与者均来自于临床研究巴塞罗那组织学分期鉴定为C期，既往接受过索拉菲尼治疗但仍有病情进展的患者。患者接受某国产抗PD-1药物（3mg/kg，q3w）治疗直至疾病进展或停止用药。在治疗开始前1个月及治疗期间，均不使用抗生素。研究人员分别在开始治疗前（基线，Day0）和每个治疗日的治疗前后收集1次患者粪便样本用于宏基因组测序，该实验应用的测序平台是华大智造DNBSEQ技术平台。根据治疗结果，患者会被分为两个组：R组和NR组。R组患者在治疗的6个月内完全或部分缓解、或疾病稳定；NR组患者疾病进展或稳定期低于6个月。研究发现基于DNBSEQ测序平台的宏基因组测序结果发现，整体而言，R组比NR组显示出微生物组更高的物种和基因数目（图1a）。而基于Bray-Curtis距离的β-多样性分析显示，R和NR两组菌群结构在治疗早期时间点并没有显著差异，而从第6周开始，R和NR两组之间显示出了显著的组间差异（图1b，图2a-d）。进一步对患者的菌群组成进行动态检测，发现治疗开始前R组和NR组的粪便菌群均以革兰氏阳性的厚壁菌门、革兰氏阴性的拟杆菌门、变形菌门为主，与健康成人的研究结果基本一致，初步推测这些患者在基线状态时并未发生严重的肠道菌群失调。图1R组和NR组在微生物多样性上的差异图2R组与NR组基于bray-cuits距离的PCoA分析在整个观察周期内，R组门水平上的微生物组成虽然有一定波动，但整体保持相对稳定的状态，而在NR组中，变形菌门在第3周开始明显增加，并有持续增加的趋势，在第12周开始占主导地位（图1c）。在种的水平上，这些占主导地位的变形菌门主要是大肠杆菌。进一步研究发现，虽然R组和NR组的菌群差异随着用药时间延长而逐渐变得显著，但对R组和NR组的每个个体而言，其自身的菌群结构仍始终保持相对稳定的个体特征（图3）。图3患者肠道菌群在整个观察周期内的Sankey图（流式图）分析于是研究人员又对R组和NR组进行LEfSe分析，结果发现20个在R组中富集的物种和15个在NR组中富集的物种（图4a）。在R组富集菌种中，有4种乳酸杆菌（Lactobacillus.oris、Lactobacillus.mucosae、Lactobacillus.gasseri、Lactobacillus.vaginalis）、1种双歧杆菌（Bifidobacteriumdentium，牙列双歧杆菌）和1种链球菌（Streptococcusthermophilus，嗜热链球菌）是具有潜在益生作用的产乳酸菌（Lacticacidbacteria），它们通过抑制病原微生物的生长和伴随的毒力因子，来增强宿主的代谢和免疫水平。之前曾有研究表明，口服双歧杆菌可提高PD-L1特异性抗体治疗的肿瘤调控效果。除此之外，Coprococcus