人参皂苷Rh2 注射液对荷肝癌( H22

人参皂苷Rh2 注射液对荷肝癌( H22

葛迎春,李晨燕,任慧君,马天舒,刘　平

　　(大连市中医研究所,大连)

　　作者简介:葛迎春(-),女,长春市人,副研究员,从事中药细胞药理学研究。

　　出自：特产研究SpecialWildEconomicAnimalandPlantResearch年第3期

　　文章编号:-()03--04

　　:本研究以荷肝癌(H22)小鼠为实验模型,观察人参皂甙Rh2注射液对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素、NK细胞毒活性和IL-2免疫指标的影响。

　　结果表明:人参皂甙Rh2注射液能提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、增加血清溶血素抗体生成能力、促进小鼠脾NK细胞杀伤活性和IL-2活性。人参皂甙Rh2注射液明显提高荷瘤小鼠免疫功能。

　　关键词:人参皂甙Rh2;免疫功能;H22肝癌瘤株

　　中图分类号:R.5 　　 　　文献标识码:A

　　人参具有广泛的药理作用,以往研究表明:人参能提高机体的免疫力[1]。本研究以H22荷瘤小鼠为实验模型,进一步观察人参皂甙Rh2注射液对荷瘤小鼠免疫功能的影响。

　　1　材料和方法

　　1.1　动物

　　昆明种小白鼠60只,体重20.74±0.77g,雌雄各半,由大连市药品检定所动物实验基地提供;H22肝癌瘤株由中国医学科学院药物研究所肿瘤室提供;淋巴细胞(YAC-1)购自武汉大学

　　菌种保藏中心。

　　1.2　仪器和试剂

　　PRMI-培养基(Gibco,USA);胎牛血清(FCS,中国医学科学院血液研究所购进,批号:20);曲拉通(TritonX,Sigma);还原型辅酶I(CoI,NADH,Sigma);阳性对照药:环磷酰胺

　　(CP,上海第十二制药厂,批号:);人参皂甙Rh2注射液、无色透明液体,由吉林省中医中药研究院提供,批号:;鸡红细胞;Giemsa染色液。CO2培养箱(SANYO,MCO-M,Japan);超净工作台(CJ-1,苏州长桥净化设备厂):紫外光度计(TU-,北京瑞利分析仪器厂);自动酶标度仪(CliniBio,EC);倒置显微镜(OLYPUS,Japan);生物学显微镜;96/24孔培养板(Costar,USA);微量血凝计数板,离心机。

　　1.3　实验分组

　　实验随机分成6组:正常对照组;无菌操作取荷肝癌(H22)小鼠腹水,用0.9%生理盐水稀释至含1×/ml,每只右腋皮下接种0.2ml(2×/只)随机分成H22荷瘤对照组;H22阳性对照组(环磷酰胺,CP);H22人参皂甙Rh2注射液高剂量组、中剂量组、低剂量组,每组10只。

　　1.4　实验方法

　　1.4.1　人参皂甙Rh2注射液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

　　给药方法:小鼠接种瘤细胞24h后开始给药,正常对照组(注射等体积的生理盐水);H22荷瘤对照组(注射等体积的生理盐水);H22阳性对照组(腹腔注射CP,20mg/kg×3,间隔3d1次);H22人参皂甙Rh2注射液高剂量组(40mg/kg)、中剂量组(20mg/kg)、低剂量组(10mg/kg),每日静脉注射1次,连续给药5d,免疫动物后继续给药5d,体积均为0.1ml/只。细胞悬液制备:取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中,朝一个方向充分摇动,以脱纤维,用生理盐水洗涤3次,离心r/min,10min,弃上清,用生理盐水配成20%(V/V)的鸡红细胞悬液。

　　吞噬功能测定:末次给药后,次日清晨每只鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1ml,轻柔腹部,30min后,颈椎脱臼处死动物,立即开腹吸取腹腔液滴在玻片上约0.2ml,玻片置入37℃,孵育30min后,再用生理盐水中漂洗,除去未贴片细胞,晾干,以1∶1丙酮甲醇溶液固定,4%(V/V)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min,蒸馏水漂洗晾干。

　　显微镜下结果判定:油镜下计数巨噬细胞,每张计数个,计算吞噬百分率和吞噬指数。

　　1.4.2　人参皂甙Rh2注射液对小鼠体液免疫的影响———血清溶血素测定血凝法SRBC:绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4℃冰箱保存备用,可保存2周。免疫动物及血清分离:取羊血,用生理盐水洗涤3次,每次离心r/min,10min,将压积SRBC用生理盐水配成2%(V/V)的细胞悬液,每只鼠腹腔注射0.2ml进行免疫,5d后,摘除眼球取血于离心管中,放置约1h,将凝固血与管壁剥离,使血清充分析出,r/min,10min,收集血清。

　　凝集反应:用生理盐水将血清倍比稀释,将不同稀释浓度的血清分别置于微量试验板内,每孔μl,再加入μl0.5%(v/v)的SRBC悬液,混匀,装入湿润的平盘内加盖,于37℃温箱孵育3h,观察血球凝集程度。

　　1.4.3　人参皂甙Rh2对荷瘤小鼠NK细胞和IL-2活性影响[2,3]

　　1.4.3.1　接种方法和实验分组:同前。

　　1.4.3.2　给药方法:小鼠接种瘤细胞24h后开始给药,每日注射1次,连续给药10d。体积均为0.1ml/只,于停药次日清晨断头处死小鼠,无菌取脾,检测NK细胞和IL-2的活性。

　　1.4.3.3　脾细胞悬液制备:无菌取脾,放置在无血清的PRMI-培养液中,将脾剪成1mm3,用注射器芯研磨至单个细胞,过目尼龙网,0r/min离心,10min,按文献制备成细胞悬液,备实验用。

　　1.4.3.4　NK细胞毒活性-胞浆乳酸脱氢酶(LDH)释放法:各实验组脾细胞为效应细胞0.1ml(2×细胞/管),加淋巴细胞(YAC-1)悬液0.1ml(2.0×细胞/管),加小牛血清0.1ml,补加培养液至1ml,每组设5个平行。自然释放管加YAC-1细胞悬液0.1ml,小牛血清0.1ml,补加培养液0.8ml。最大释放管每管加YAC-1细胞悬液0.1ml,小牛血清0.1ml,补加1%Triton-0.8ml。上各试验组置37℃,5%CO2的培养箱中,饱和湿度培养18h,0r/min,离心5min,取全部上清液。加LDH反应液3ml,用分光光度计以nm,32℃恒温测定吸光度值。

　　1.4.3.5　IL-2的制备和活性检测:　IL-2的诱生:无菌制脾细胞悬液方法同前,用PRMI-培养液洗涤2次,配成1×个/ml细胞悬液,每孔μl,加入96孔培养板中,使每孔细胞为5×个。离心收集上清液,置-20℃冰箱保存备用。制备活化的脾细胞悬液:无菌制脾细胞悬液方法同前,制成5×个/ml细胞悬液,加入ConA,使其浓度为5μl/ml,置37℃,5%CO2饱和湿度培养48h,收集细胞,离心2次,重悬于PR2MI-培养液中,作为IL-2活性检测细丙。

　　IL-2活性检测:取-20℃保存的IL-2上清液和检测小鼠脾细胞,在96孔培养板中,每孔加入IL-2上清液和反应细胞各μl,阴性对照组加μlPRMI-培养液,各设4个平行样。置37℃,5%CO2饱和湿度培养48h,每孔加入MTT(5mg/ml)10μl,继续培养4h,弃上清,加入酸化异丙醇μl,充分振荡后静置20min,全自动酶标仪MTT法比色分析法测定IL-2活性(OD值)。

　　2　实验结果

　　人参皂甙Rh2注射液对小鼠免疫功能的影响(见表1-4)

　　表1　人参皂甙Rh2注射液对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

　　分　组剂量动物数吞噬百分率(%)

　　(mg/kg)(.x±SD)

　　对照组-.2±3..7±3.47

　　H.70±4.59Δ37.7±5.40

　　H22+CP.3±3.80ΔΔ31.4±6.60ΔΔ

　　H22+Rh.1±4..0±4.

　　H22+Rh.6±2..2±5.

　　H22+Rh.7±3..4±2.

　　H22Rh2各剂量组与H22组比较有明显差异,3:P0.05;33:P0.01;:P0.;H22和H22CP组与正常对照组比

　　较显著降低,Δ:P0.05;ΔΔ:P0.01。

　　表1实验结果表明:人参皂甙Rh2注射液各剂量组能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。环磷酰胺明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。

　　表2　人参皂甙Rh2对荷瘤小鼠体液免疫的影响—血清溶血素抗体测定血凝法

　　分组剂量(mg/kg)动物数抗体积数(.x±SD)

　　对照组-.4±6.82

　　H22-.4±3.89Δ

　　H22+CP.2±3.12ΔΔΔ

　　H22+Rh.6±4.45

　　H22+Rh.7±8.

　　H22+Rh.4±3.

　　H22Rh2注射液高、中剂量组和低剂量组与H22荷瘤对照组比较显著升高,3:P0.05;33:P0.01;:P0.;

　　H22CP组、H22与正常对照组比较有显著降低作用ΔΔΔ:P0.;Δ:P0.05。

　　表2实验结果表明:人参皂甙Rh2注射液各剂量组抗体数明显高于对照组和CP组,说明人参皂甙Rh2注射液组有明显促进荷瘤小鼠体液免疫功能的作用,而环磷酰胺组则明显抑制

　　体液免疫功能的作用。

　　表3　人参皂甙Rh2注射液对荷瘤H22小鼠NK细胞活性的影响

　　分　组剂量动物数LDU(IU)细胞毒指数(%)

　　(mg/kg)(.x±SD)

　　对照组-.59±1..62±7.13

　　H22-.27±1..70±10.69ΔΔ

　　H22+CP20.43±0..63±6.69ΔΔ

　　H22+Rh.95±0.93.12±10.7

　　H22+Rh.32±1.78.94±11.

　　H22+Rh.84±1..85±11.92

　　人参皂甙Rh2注射液各剂量组与荷瘤H22组比较,33:P0.01;3:P0.05;H22和H22+CP与正常对照组比较细胞毒指数显著降低,ΔΔ:P0.01。

　　表3实验结果表明:人参皂甙Rh2注射液高、中剂量组与荷瘤组比较NK细胞杀伤活性明显增强,人参皂甙Rh2注射液高剂量组IL-2活性显著高于荷瘤组。

　　表4　人参皂甙Rh2注射液对荷瘤小鼠脾细胞IL-2活性的影响

　　分　组剂量(mg/kg)动物数IL-2活性(OD值)

　　(.x±SD)

　　对照组-10 　　　　0.±0.

　　H22-10 　　 　　0.±0.Δ

　　H22+CP 　　 　　0.±0.Δ

　　H22+Rh 　　 　　0.±0.

　　H22+Rh2 　　 　　0.±0.

　　H22+Rh 　　 　　0.±0.

　　H22Rh2注射液高剂量与荷瘤H22组比较,3:P0.05。H22和H22+CP与正常对照组比较,Δ:P0.05。

　　表4实验结果表明:人参皂甙Rh2注射液高剂量组IL-2活性显著高于荷瘤组。

　　3　讨论

　　人参皂甙Rh2是从人参中提取的单体皂甙成分之一。本研究进一步探讨人参皂甙Rh2对荷瘤小鼠免疫功能的影响,结果表明:人参皂甙Rh2注射液能提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞

　　噬功能和促进荷瘤小鼠血清中羊红血球抗体生成。NK细胞是细胞免疫中非特异部分,很多研究发现H22荷瘤机体NK细胞活性明显降低[4],本实验也得到同样的结果。即荷肝癌(H22)模型组小鼠的NK细胞活性处于严重低下状态,而人参皂甙Rh2注射液高、中剂量组与荷瘤组比较NK细胞杀伤活性有明显增强。IL-2主要是由活化的辅助性T淋巴细胞产生的细胞因子,IL-2具有自身正向免疫调节作用,但在大多数荷瘤机体,IL-2系统处于明显的抑制或紊乱,

　　荷瘤小鼠的IL-2活性低于正常组,而人参皂甙Rh2注射液高剂量组显著提高IL-2活性。人

　　参皂甙Rh2注射液通过调节和增强机体免疫功能,发挥其抗肿瘤作用。

　　参考文献:

　　[1]王本祥.人参研究[M].天津:天津科学技术出版社,.-.

　　[2]杨贵贞.免疫生物工程纲要与技术[M]长春:吉林科学技术出版社,.48.

　　[3]周道洪,沈元珊,赵曼瑞.测定淋巴细胞转化和鼠白细胞介素2活性的新方法-MTT比色分析法[J].中国

　　免疫学杂志,,2(1):39.

　　[4]彭贵勇,袁爱力,蔡景修.荷瘤小鼠脾细胞淋转NK和LAK活性[J].上海免疫学杂志,,14(4):